Oncología Molecular

Equipo de trabajo

Proyecto de investigación

PARTICIPACIÓN Y REGULACIÓN DE ZEB1 Y SU INTERACTOMA EN LOS MECANISMOS MOLECULARES DE TRANSFORMACIÓN NEOPLÁSICA CELULAR

OBJETIVOS GENERALES DEL PROYECTO

La Transición Epitelio-Mesenquimatosa (EMT) se define como la conversión de una célula epitelial a mesenquimatosa con la adquisición de propiedades migratorias e invasivas las que son imprescindibles durante el desarrollo embrionario, pero que son de ocurrencia patológica en la vida postnatal como durante la metástasis tumoral y los procesos de fibrosis. La EMT es inducida tanto por factores del medio extracelular (TGFβ, Notch, IGF-1, Wnt, etc) como del intracelular (factores de transcripción -FT- y/o vías de señalización que responden a señales externas). Entre los factores intracelulares aludidos anteriormente, se destaca ZEB1 (Zinc Finger E-box Binding Homeobox), un FT importante en la diferenciación de células derivadas del mesodermo y de la cresta neural y en el EMT. Se ha demostrado que ZEB1 tiene una activa participación en la inducción de EMT en tumores epiteliales (colon, próstata, mama, etc.), incluso se lo postula como un factor pronóstico y posible blanco terapéutico de neoplasias epiteliales. A pesar de ello, aun no está completamente definido qué señal(es) y cómo regulan a ZEB1 durante la EMT. Se ha demostrado que ZEB1 es factor clave en la aparición de EMT inducida por la señal TGFβ. Resultados previos de nuestro grupo (Lorenzatti et al, 2011) mostraron que la disminución del factor extracelular CCN6 induce (a través de la vía IGF-1) el aumento en el nivel de expresión de ZEB1 en líneas celulares de cáncer de mama lo que se asoció con la activación del programa EMT en dichas células. Por otro lado, observamos que la actividad transcripcional de ZEB1 es modificada ante cambios del estado de fosforilación de la proteína promovidos principalmente por las vías de PKC y MAPK/MEK/ERK (Llorens et al, 2013; Lorenzatti et al, 2015, en revisión). La activación o represión de mecanismos de señalización son importantes reguladores de la función celular y de allí la importancia del estudio de dichas vías como reguladoras de la función de factores asociados a cáncer y al EMT como el propuesto en el presente proyecto para ZEB1. Nuestro trabajo intenta aclarar el rol de la fosforilación de ZEB1 con el estimulo de haber sido identificado como un vacio en el conocimiento en los últimos reviews escritos sobre ZEB1. Cabe mencionar que en los últimos años ha cobrado importancia en la terapia del cáncer el conocimiento de las vías de señalización intracelular cuya sobreexpresión desregulada es causal de crecimiento y metástasis tumoral. Este conocimiento ha generado una batería de drogas antineoplásicas (inhibidores de vías de señalización involucradas como tirosina quinasas, etc) que actualmente se usan con éxito en la terapia del cáncer.

Considerando que las decisiones de destino celular son reguladas por factores intra y extracelulares y que ZEB1 es un elemento crítico en la diferenciación celular tanto normal como en neoplasias, la hipótesis general es que dicha función de ZEB1 es regulada a distintos niveles (pre, post transcripcionales y post traduccionales) por elementos presentes en el medio ambiente intra (modelo estocástico de compromiso de linaje) o extracelular (modelo de regulación extrínseca), cuyo desbalance lleva al desarrollo de procesos de carcinogenesis y leucemogenesis como consecuencia de la desregulación de ZEB1. Una pregunta clave para avanzar en el conocimiento del compromiso de ZEB1 con su función en la célula normal o la desregulada es cuáles son los mecanismos de control que operan sobre este factor durante la EMT en neoplasias.

Por lo tanto, el objetivo general de este proyecto es caracterizar la regulación funcional de ZEB1 y su rol en los procesos que llevan a la diseminación hematógena de tumores vía EMT a fin de traducir su biología en herramientas de utilidad clínica para el diagnóstico y terapéutica de las enfermedades neoplásicas en las que ZEB1 se encuentra involucrado.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Teniendo en cuenta el rol crucial de ZEB1 en la invasión tumoral y nuestros resultados previos que asocian estado de fosforilación de ZEB1 con su actividad transcripcional, es nuestro interés focalizarnos en estudiar distintos niveles de la complejidad de la regulación de ZEB1, su interrelación mecanística con otros factores intracelulares (FT, coactivadores, vías de señalización, etc.) y del microambiente celular en los procesos de diferenciación y transformación celular usando células normales y tumorales de mama.

Identificar mecanismos post traduccionales de regulación de ZEB1 en células neoplásicas y no neoplásicas. Estudios de espectrometría de masa y de ganancia y pérdida de función permitirán localizar los sitios de fosforilación en ZEB1 y delimitar la participación de vías de señalización intracelular. Se evaluará la participación de las vías en líneas epiteliales NMuMG y/o MDCK (modelo in vitro de EMT) y de mama normal (HME y MCF10A), no invasivos (MCF-7) e invasivos y metastatizantes (MDA-MB-231). Para definir el rol biológico de ZEB1 en el EMT será particularmente importante comparar diferencias entre neoplasias benignas y malignas de distinto grado de agresividad. Se evaluarán: a) grado y sitios de fosforilación de ZEB1 (espectrometría de masa, mutagénesis, western blot (WB) con anticuerpos (Ac) específicos anti fosfoproteínas); b) capacidad de unión de ZEB1 a sus DNA blanco por Noshift transcription assay (EMSA en placa) y ChIP (inmunoprecipitación de cromatina); c) actividad transcripcional de ZEB1 sobre sus promotores blanco por ensayos de genes reportadores. Tomados en conjunto, estos datos permitirán establecer la participación de vías de señalización sobre la función biológica de ZEB1 en la inducción del EMT y la progresión del cáncer.

1B) Investigar la relevancia de la fosforilación de ZEB1 en el EMT y en el desarrollo de los procesos de invasión y metástasis del cáncer de mama. El siguiente paso es investigar si la vía descripta es relevante para el desarrollo de metástasis y la activación del programa EMT, lo que se estima a través del cambio en la capacidad de invasión y proliferación celular. Con tal fin, se medirá la expresión de los marcadores de EMT (E‐cadherina, vimentina, ZO‐1, etc.) por WB y qRT‐PCR e IF (inmunofluorescencia) así como también la migración e invasión celular la que será evaluada por ensayos in vitro de movilidad al azar y de invasión al Matrigel (Lorenzatti et al, 2011), respectivamente en las células en 1A. Sera particularmente útil el uso de las células NMuMG las cuales al brindar un modelo “in vivo” de EMT serán evaluadas en su capacidad de inducción del EMT en presencia de mutantes silentes o fosfomiméticas de fosfositios de ZEB1 identificados en 1A.

2A) Determinar la relevancia biológica de los cambios de localización subcelular de ZEB1 por MEK/ERK y PKC. La fosforilación suele modificar la localización de proteínas. Hemos observado que la fosforilación inducida por IGF-1 o PMA sobre fragmentos de ZEB1 tanto N- como C-terminales inducen un cambio de localización celular de ZEB1. Es nuestro interés determinar si este efecto tiene por objeto la degradación de la proteína en citosol por proteasomas o si por el contrario genera una función novel de la misma. Asimismo, estudiaremos si mecanismos canónicos de exportación/importación nuclear de proteínas están involucrados.

2B) Relacionar distribución subcelular con función. Las células serán sometidas a IF y microscopía confocal y analizadas por distintos marcadores de estructuras citosólicas y subnucleares (Golgi, speckels, nucleolos, asociación a heterocromatina, etc). Se podrá inferir si ZEB1 se regula por cambios en la localización, si es constitutivamente nuclear o si se asocia con alguna estructura conocida, y si la ubicación de ZEB1 es compatible con un proceso activo de transcripción, splicing de RNA, escape al citoplasma, etc.

3. Investigar el mecanismo de acción de las vías de fosforilación identificadas en 1.

3A) Estudiar las isoformas de PKC involucradas en la fosforilación de N-ZEB1 mencionado en 1, y su mecanismo de acción (directo o indirecto a través de otros factores) sobre el FT. Este objetivo se realizara con la colaboración del Dr. Marcelo Kazanietz mediante técnicas de WB, IP, siRNA, genes reportadores, etc. y herramientas in vivo.

3B) Determinar si las vías de señalización actúan directamente sobre ZEB1 y/o a través de modificaciones de la interacción de ZEB1 con sus correpresores como CtBP1, CtBP2 o coactivadores como p/CAF /p300. Se investigara mediante técnicas de WB, inmunoprecipitación (IP) y ChIP si la activación/inhibición de las vías intracelulares de señalización induce cambios en la interacción de ZEB1 con sus correpresores y coactivadores (CtBP, P/CAF) y si ello repercute en la progresión tumoral y EMT inducida por ZEB1 mediante ensayos de invasión, proliferación, marcadores de EMT (WB), etc. Se usaran además, ensayos de genes reporteros para evaluar el efecto de fosforilación de correpresores y coactivadores sobre la activación génica (en presencia de mutantes inactivantes de ZEB1 y/o de siRNA de los elementos del interactoma).

3C)Evaluar si ZEB1 es regulada por SUMOilacion. Es nuestro interés determinar el efecto de esta modificación postraduccional sobre las respuestas biológicas de ZEB1 a través de ensayos de pull-down, IP, ChIP y genes reportadores con clones nativos y/o mutados de los distintos componentes del sistema.

4. Investigar el entrecruzamiento de señales (cross-talk) entre las vías identificadas en 1 como reguladoras de ZEB1 y TGFβ sobre la EMT inducida por estos últimos. Nuestra hipótesis es que ZEB1 es el punto de convergencia entre señales provenientes del medio extracelular (TGFβ y las identificadas en 1). Se determinará la activación de promotores dependientes de ZEB1 y la inducción de EMT por TGFβ en células NMuMG y MDCK en situaciones experimentales de activación/inhibición de vías seleccionadas (como en 1) como marcadores del efecto de los factores en estudio. Nuestra hipótesis de trabajo es que las vías identificadas en 1, actuando en forma paralela o en “cross-talk” con TGFβ determinarían el estado cuali y cuantitativo de fosforilación de ZEB1 en la célula normal, el cual al modificarse en la célula tumoral desregulada induciría un cambio en la función normal de ZEB1 lo que resultaría en la inducción de metástasis.

Publicaciones

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